Sodio cloruro in media di coltura cellulare e buffer fisiologici: specifiche tecniche e applicazioni

Il sodio cloruro (NaCl, CAS 7647-14-5, CE 231-598-3, M = 58,44 g/mol) è il maggior contributo singolo all'osmolalità dei terreni di coltura cellulare e dei tamponi fisiologici. Fornisce la maggior parte degli ioni Na⁺ e Cl⁻ di cui le cellule hanno bisogno per mantenere volume e potenziale di membrana; bicarbonato di sodio, fosfato di sodio e altri sali forniscono il resto del sodio.

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Quanto NaCl contengono i terreni e i tamponi più comuni?

Contenuto di NaCl delle formulazioni classiche, per litro di terreno 1×:

• DMEM: 6,4 g/L (110 mM)
• RPMI-1640: 6,0 g/L (103 mM)
• MEM (sali di Earle): 6,8 g/L (116 mM)
• Ham's F-12: 7,6 g/L (130 mM)
• PBS (Dulbecco, 1×): 8,0 g/L (137 mM)
• HBSS: 8,0 g/L (137 mM)
• Soluzione fisiologica allo 0,9 %: 9,0 g/L (154 mM)

I terreni contengono meno NaCl del PBS perché il bicarbonato di sodio (3,7 g/L, cioè 44 mM, nel DMEM; 2,0 g/L, cioè 24 mM, nell'RPMI-1640) e il fosfato di sodio apportano sodio e osmolalità aggiuntivi. Il Na⁺ totale della maggior parte dei terreni è quindi intorno a 135–155 mM, vicino ai 135–145 mM del plasma umano. Le varianti dei produttori (ad esempio con diverso contenuto di glucosio o HEPES) possono discostarsi: fa fede la scheda di formulazione del prodotto effettivamente utilizzato.

Perché l'osmolalità è importante?

La maggior parte delle linee cellulari di mammifero cresce bene tra circa 260 e 340 mOsm/kg, e la maggior parte dei terreni è formulata a 280–320 mOsm/kg; il plasma umano è a 275–295 mOsm/kg. Ogni millimole di NaCl per litro aggiunge poco meno di 2 mOsm/kg. In un terreno ipertonico l'acqua esce dalle cellule, che si raggrinziscono; in un terreno ipotonico si gonfiano e, se la differenza è abbastanza grande, vanno incontro a lisi.

Poiché il NaCl è il contributo maggiore, è il componente che di solito si regola quando occorre correggere l'osmolalità, per esempio dopo l'aggiunta di HEPES, supplementi o farmaci sciolti in acqua. Conviene misurare il risultato con un osmometro anziché affidarsi al calcolo; inoltre l'evaporazione in incubatore fa aumentare l'osmolalità nel tempo.

Che ruolo ha il NaCl nei tamponi come il PBS?

Il NaCl non tampona il pH: nel PBS questo compito spetta al fosfato. Il NaCl determina la tonicità e la maggior parte della forza ionica (circa 0,17 M nel PBS 1×). La forza ionica influenza le interazioni proteina-proteina e anticorpo-antigene; per questo i tamponi di lavaggio e di diluizione per ELISA e Western blot sono di norma PBS o TBS con 137–150 mM di NaCl. Alcune purificazioni proteiche usano più sale, per esempio 300 mM di NaCl nei tamponi di lisi per la cromatografia di affinità al nichel, per ridurre i legami aspecifici.

Quale grado usare?

Per la coltura cellulare e la preparazione di tamponi conviene un grado con specifica definita e certificato di analisi (CoA) del lotto:

• Gradi farmacopea (Ph. Eur., USP, JP): titolo 99,0–100,5 % sulla sostanza essiccata, con limiti per impurezze come solfato, bromuro, ioduro, ferro e bario. Per la produzione GMP si usa normalmente un grado farmacopea da un fornitore qualificato.
• Grado reagente ACS: titolo almeno 99,0 % con limiti di impurezze definiti. Adatto alla maggior parte dei tamponi di laboratorio, ma di solito non testato per le endotossine.
• Gradi testati per coltura cellulare o a basso contenuto di endotossine: aggiungono il saggio delle endotossine (metodo LAL, Ph. Eur. 2.6.14 / USP <85>) e talvolta un test di crescita cellulare. I limiti sono fissati da ciascun fornitore: confrontate le specifiche, non solo il nome del grado.

Il sale da cucina non è adatto: contiene antiagglomeranti e spesso ioduro o iodato aggiunto.

Preparazione e conservazione

Il NaCl è chimicamente stabile. Conservate il contenitore ben chiuso, all'asciutto e a temperatura ambiente, perché il solido assorbe umidità e si compatta quando l'aria è umida. Preparate le soluzioni con acqua di laboratorio purificata (tipo I o equivalente); le soluzioni di NaCl si possono sterilizzare in autoclave o per filtrazione a 0,22 µm.

Il sodio cloruro è registrato ai sensi di REACH, figura nell'inventario TSCA statunitense e non è classificato come pericoloso secondo GHS/CLP. Queste norme riguardano l'immissione sul mercato e le informazioni di sicurezza; l'idoneità di un lotto alla coltura cellulare è data dalla specifica del grado e dal suo CoA.

Domande frequenti

• Quanto NaCl contiene il PBS 1×? 8,0 g/L, cioè 137 mM (formulazione di Dulbecco), insieme a 2,7 mM di KCl e circa 10 mM di fosfato.

• Perché il DMEM contiene meno NaCl del PBS? Il bicarbonato di sodio (3,7 g/L nel DMEM) e il fosfato di sodio apportano sodio e osmolalità aggiuntivi, quindi serve meno NaCl. Il Na⁺ totale del DMEM è di circa 155 mM.

• Quale grado di NaCl usare per la coltura cellulare? Un grado farmacopea (Ph. Eur./USP) o un grado testato per la coltura cellulare, con certificato di analisi del lotto. Se le endotossine sono importanti, scegliere un grado testato per le endotossine; il grado reagente ACS di solito non lo è.

• Si può usare il sale da cucina? No. Il sale da cucina contiene antiagglomeranti (spesso ferrocianuri) e spesso ioduro o iodato aggiunto, e il suo profilo di impurezze non è specificato.